Лабораторный практикум по микробиологии. Методические рекомендации по выполнению практических работ основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевом производстве

Название: Микробиология, вирусология и иммунология полости рта
Царев В.Н.
Год издания: 2013
Размер: 81.64 МБ
Формат: djvu
Язык: Русский
Описание: Практическое руководство "Микробиология, вирусология и иммунология полости рта" под ред., Царева В.Н., рассматривает вопросы общие вопросы микробиологии и микрофлоры ротовой полости человека. Предста... Скачать книгу бесплатно

Название: Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. 2-е издание
Воробьев А.А.
Год издания: 2012
Размер: 32.73 МБ
Формат: pdf
Язык: Русский
Описание: Практическое пособие "Медицинская микробиология, вирусология и иммунология" под ред., Воробьева А.А., и соавт., рассматривает базовые разделы общей микробиологии а также иммунологии и вирусологии. Осв... Скачать книгу бесплатно

Название: Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии
Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А.
Год издания: 2012
Размер: 5.72 МБ
Формат: pdf
Язык: Русский
Описание: Учебное руководство "Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии" под ред., Прозоркина Н.В., и соавт., рассматривает основной материал общей микробиологии, вирусологии и иммунологии. Изложены исто... Скачать книгу бесплатно

Название: Руководство к практическим занятиям по микробиологии
Егоров Н.С.
Год издания: 1995
Размер: 2.04 МБ
Формат: djvu
Язык: Русский
Описание: В книге "Руководство к практическим занятиям по микробиологии" под ред., Егоров Н.С., освещены современные лабораторные диагностические методы в области вирусологии и микробиологии, рассмотрены идент... Скачать книгу бесплатно

Название: Микробиология с основами вирусологии
Колешко О.И., Завезенова Т.В.
Год издания: 1999
Размер: 8.71 МБ
Формат: djvu
Язык: Русский
Описание: В учебном руководстве "Микробиология с основами вирусологии" под ред., Колешко О.И., и соавт., рассмотрены общая микробиология с рассмотрением морфофизиологии бактерий, генетика бактерий, микрофлора б... Скачать книгу бесплатно

Название: Медицинская микробиология и иммунология
Воробьев А.А.
Год издания: 1999
Размер: 14.3 МБ
Формат: djvu
Язык: Русский
Описание: Учебное пособие "Медицинская микробиология и иммунология" под ред., Воробьева А.А., рассматривает основные разделы общей микробиологии а также иммунологии. Представлены исторические вехи развития микр... Скачать книгу бесплатно

Название: Медицинская микробиология, вирусология и иммунология
Воробьев А.А.
Год издания: 2004
Размер: 12.81 МБ
Формат: djvu
Язык: Русский
Описание: Учебное пособие "Медицинская микробиология, вирусология и иммунология" под ред., Воробьева А.А., рассматривает основные разделы общей микробиологии а также вирусологии и иммунологии. Представлены исто... Скачать книгу бесплатно

Название: Мікробіологічна діагностика бактеріальних інфекцій
Жданівський М.В., Щукін І.М., Слюсарев О.А., Ніколенко Ю.І.
Год издания: 2007
Размер: 6.72 МБ
Формат: djvu
Язык: Украинский
Описание: Учебное пособие "Мікробіологічна діагностика бактеріальних інфекцій" под ред., Жданівського М.В., и соавт., рассматривает микробиологическую диагностику группы бактериальных инфекций. Описана методика...

Департамент образования города Москвы

Технологический колледж №28

Жукова Л.А.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

Для учащихся профессии НПО

Москва

2012

«Основы микробиологии, санитарии и гигиены»

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

для учащихся профессии НПО

34.17 Оператор процессов колбасного производства.

_______________________________________________________________

Пособие предназначено студентам колледжа. Может быть использовано для самостоятельной подготовки к учебным занятиям и внеаудиторной самостоятельной работе.

Составитель: Жукова Л.А. – преподаватель специальных дисциплин

Рецензент: Суханова Н.В.– преподаватель специальных дисциплин

Редактор: Малькова Л.А. – заместитель директора по учебно-методической работе

Рукопись рассмотрена и обсуждена на заседании ЦМК Технологических дисциплин, протокол № __ от __ _______ 2012г.

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Методические указания разработаны в соответствии с действующей программой курса микробиологии, принятой ГАОУ СПО города Москвы Технологическим колледжем №28 для студентов, обучающихся по специальности 260301 «Технология мяса и мясных продуктов».

На современном уровне развития естественных наук требуются глубокие знания микробиологических процессов, лежащих в основе многих биотехнологических производств и служащих гарантией защиты окружающей среды от антропогенного воздействия.

Помимо приобретения теоретических знаний по микробиологии будущим специалистам необходимы лабораторно-практические занятия, являющиеся по сути небольшими научно-исследовательскими работами.

Выполнение лабораторных работ обеспечивает закрепление теоретических знаний студентов, развитие навыков по микробиологическому контролю и способностей к самостоятельным выводам и обобщениям.

Данные методические указания по выполнению лабораторных работ предлагают:

объединить лабораторные работы по одной теме или имеющие одно смысловое содержание так, чтобы удобно было их организовать во времени, как это требует специфика микробиологических анализов;

распределить занятия так, чтобы загруженность последнего занятия давала возможность обсудить результаты анализа, провести зачет по выполненной работе;

сконцентрировать наиболее важный учебный материал, позволяющий студентам без излишней загруженности освоить практические навыки работы в микробиологической лаборатории;

дать методику проведения анализа с указанием сущности метода, техники выполнения, правил обработки результатов;

использовать те методы микробиологического анализа, которые предусмотрены ГОСТом.

Тема и цель работы.

Материальное обеспечение лабораторной работы.

Рекомендации по выполнению лабораторной работы, задание, пояснение к работе, методика проведения анализов, формы для составления отчета, контрольные вопросы к лабораторным вопросам и дополнительная литература.

Ввиду сложности некоторых методов и длительности выращивания микроорганизмов в отдельных случаях часть лабораторного материала готовит заранее преподаватель, но методика приготовления его приводится.

Навыки, приобретенные на лабораторных занятиях, необходимы для проведения микробиологического контроля производства, цель которого заключается в том, чтобы своевременно выявить нарушение санитарного состояния производства и оборудования, обнаружить места и пути микробного загрязнения, принять необходимые меры по ликвидации этих опасных очагов и добиться выпуска продукции высокого качества.

ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Работа в микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения специальных правил, что определяется двумя основными положениями.

Первое – в микробиологической практике используют, главным образом, чистые культуры микроорганизмов, т. е. популяции микроорганизмов одного вида, часто являющихся потомством одной клетки.

Поскольку в воздухе, на поверхности окружающих нас предметов, на одежде, руках, волосах всегда имеется большое количество разнообразной микрофлоры, то для обеспечения стерильности исследований и во избежание загрязнения культур работа должна проводиться с соблюдением правил асептики.

Второе – при исследованиях с неидентифицированными микроорганизмами, при их выявлении из объектов окружающей среды и техногенных потоков, могут быть выделены патогенные и условно патогенные микроорганизмы.

Кроме того, клетки как сапрофитных, так и патогенных микроорганизмов могут являться аллергенами для определенных индивидуумов. Таким образом, для получения достоверных результатов исследований, для обеспечения личной безопасности и безопасности окружающих необходимо соблюдение определенных правил.

При пересевах микроорганизмов стерильность достигается за счет того, что вся работа проводится вблизи пламени горелки. Бактериологические петли, используемые для пересева микроорганизмов с твердых сред, прокаливают в пламени горелки, а стеклянную посуду и питательные среды предварительно стерилизуют в сушильных шкафах и в автоклавах соответственно.

Поверхность рабочего стола дезинфицируют как перед работой, так и после её окончания, протирая 3%-ным раствором хлорамина, лизола или 70%-ным раствором изопропилового или этилового спирта. Растворы данных спиртов могут применяться и для дезинфекции рук.

Подготовка помещения включает мокрую уборку и тщательную вентиляцию с последующим облучением ультрафиолетовым светом бактерицидных ламп. В зависимости от степени загрязненности воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 минут до нескольких часов. Ультрафиолетовые лучи опасны для глаз, поэтому при включенной бактерицидной лампе в помещении находиться нельзя.

При работе в микробиологической лаборатории учащиеся должны соблюдать следующие правила:

1. Каждый студент должен работать на постоянном месте.
2. На рабочем месте не должно быть посторонних предметов (в том числе портфелей и сумок). Во время работы с горелкой на столе не должно быть также и тетрадей, которые понадобятся позже при микроскопии и зарисовке препаратов.
3. Вся работа выполняется в чистом халате. Длинные волосы должны быть подобраны, во избежание их попадания в пламя грелки.
4. На посуде, применяющейся для культивирования микроорганизмов (пробирках, колбах, чашках Петри, матрацах), должны быть сделаны надписи, содержащие родовое и видовое название культуры, дату засева, фамилию студента и номер группы.
5. Все предметы, использованные при работе с живыми культурами, должны быть обеззаражены либо обжиганием в пламени горелки, либо погружены в дезинфицирующий раствор (предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели).
6. Все засеянные пробирки, чашки или колбы помещаются в термостат или сдаются лаборанту.
7. Отработанный материал помещается в определенные емкости для их дальнейшего обеззараживания.
8. В лаборатории строго запрещается курение и прием пищи.
9. В конце занятий каждый студент должен привести в порядок рабочее место.

Полученные данные должны быть зафиксированы в журнале для лабораторных работ. Записи должны содержать: номер и название работы, дата её начала и окончания, названия объектов исследований, условия проведения опытов, методы анализов, а также полученные результаты и выводы из них. При изучении морфологии культур делаются их зарисовки при определенных увеличениях микроскопа. (На занятиях следует иметь цветные карандаши, как минимум красный и синий.) Цифровые данные обобщаются в таблицах, графиках или диаграммах.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

Организация и оборудование микробиологической лаборатории. Устройство оптического микроскопа и правила работы с ним. Освоение техники микроскопирования микробов.

Цель занятия .

Ознакомить студентов с организацией и оборудованием микробиологической лаборатории. Изучить устройство оптического микроскопа. Ознакомиться с основными формами бактерий.

Материальное обеспечение.

Учебная микробиологическая лаборатория, оснащенная термостатами, стерилизаторами, холодильниками, водяной баней, дистиллятором, бактерицидными лампами, рабочими столами со всеми необходимыми принадлежностями, микроскопами.

Данная лабораторная работа содержит значительный объем учебного материала, поэтому ознакомить студентов с организацией и оборудованием лаборатории желательно демонстрационным методом.

При изучении устройства микроскопа использовать плакат, где показаны все его детали.

Задания.

1. Ознакомиться с пояснением к работе:

1. Оборудование учебной микробиологической лаборатории.
2. Оснащение и организация работы производственной

1. Правила работы в микробиологической лаборатории.
2. Устройство оптического микроскопа и уход за ним.

Правила работы с микроскопом МБР-1.

1. Основные формы бактерий.

1. Провести микроскопию готовых препаратов с основными формами

Бактерий.

Пояснение к работе

1.1 Оборудование учебной микробиологической лаборатории.

Помещение учебной микробиологической лаборатории должно состоять из учебной, технической комнат и комнаты преподавателя.

В учебной комнате должен быть следующий инвентарь: лабораторные столы, столы для микроскопирования, стол для преподавателя, термостаты, табуреты, полка с титрованными растворами, весы, классная доска, стол для посуды, раковина.

Для учебных занятий может быть использован обычный лабораторный стол.

Стол для микроскопирования необходимо устанавливать перед окном; его высота должна быть около 80 см, ширина – около 40 см. Для большей устойчивости стол для микроскопирования устраивают на кронштейнах.

Термостаты. Микробы необходимо выращивать при таких условиях, чтобы температура окружающего воздуха подвергалась, возможно, меньшим колебаниям. Для этого применяют термостаты, представляющие собой шкафы, в которых поддерживается постоянная температура.

Существуют воздушные и водяные термостаты.

Воздушные термостаты обогреваются теплым воздухом, нагреваемым, как правило, электрическим током.

В водяных термостатах между двойными стенками находится вода, нагреваемая электрическим током, газом или другими источниками тепла. Колебания температуры в этих термостатах меньше, чем в воздушных.

В лаборатории должно быть не меньше трех термостатов: температура одного 30˚С, второго 37˚С и третьего 43˚С. Микробов, хорошо развивающихся при 20˚С, можно выращивать при комнатной температуре.

Постоянная температура в термостатах поддерживается специальными приспособлениями – терморегуляторами. В термостате с точным терморегулятором колебания температуры не должны превышать 2˚С.

Автоклав, или стерилизатор. Автоклав представляет собой металлический цилиндр с двойными стенками и массивной крышкой, которая закрывается винтовыми зажимами.

На цилиндр надевается металлический кожух. Автоклав снабжен пароотводной трубкой, манометром, предохранительным клапаном и водомерным стеклом. В нем стерилизуют питательные среды, различные жидкости и посуду.

Перед стерилизацией в автоклав через воронку водомерного стекла наливают дистиллированную или кипяченую воду (при употреблении сырой воды быстро образуется накипь) до черты, указанной на кожухе автоклава. После этого автоклав загружают подлежащим стерилизации материалом (последний необходимо сверху закрывать бумагой), крепко завинчивают крышку, открывают кран пароотводной трубки и начинают подогревать.

Нагрев осуществляется электричеством, паром (в этом случае воду в автоклав не наливают) или несколькими газовыми горелками. По мере нагревания из автоклава начинает выходить сначала воздух, а затем пар, который поступает в автоклав через отверстия в верхней части цилиндра. Когда пар начнет выходить непрерывной струей, его выпускают еще 2-3 минуты для вытеснения воздуха из автоклава, а затем кран закрывают. Вследствие этого прекращается выход пара и постепенно в автоклаве начинает повышаться давление (подъем стрелки манометра).

После установления требуемого давления степень нагревания автоклава уменьшают так, чтобы стрелка манометра оставалась на одном уровне в течение определенного времени. Начало стерилизации считается с момента достижения стрелкой надлежащего давления.

Показания манометра соответствуют определенной температуре пара.

Показания манометра в ати Температура пара в ˚С

0,5 112,0

1,0 121,4

1,5 128,8

2,0 135,1

По окончании стерилизации нагревание прекращают и дают стрелке манометра упасть до нуля. Только после этого открывают кран пароотводной трубки, выпускают пар и впускают воздух, затем отвинчивают крышку, поднимают её и, дав в таком положении остыть автоклаву, вынимают простерилизованный материал.

Посуда и инвентарь.

Чашки Петри служат для посева культур. Употребляют чашки диаметром 10 см (высота 1,5см). Стекло должно быть тонким, прозрачным, без пузырьков воздуха.

Пипетки. При бактериологической работе используют пипетки емкостью 1 -5 и 10 мл. Чаще всего применяются пипетки емкостью 1 мл, длиной около 28 см (без расширения).

Пробирки. Для разливания воды по 10 мл применяются пробирки размером 18 х 2,0 см; используют также пробирки размером 18 х 1,5 см. Для питательных сред используют пробирки размером 15 х 1,8 см.

Иглы и петли. Для взятия исследуемого материала и для посевов пользуются иглами и петлями.

Для мытья лабораторной посуды необходим стол с ванной для мойки .

При работе с микроскопом используют предметные и покровные стекла . Стекла должны быть бесцветными с ровной поверхностью, без пузырьков воздуха. Для специальных исследований применяют предметные стекла с лунками.

1.2 Оснащение и организация работы производственной

Микробиологической (бактериологической) лаборатории.

Бактериологическое исследование продовольственного сырья и продуктов из него проводят в специальной лаборатории, имеющей разрешение на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности. Микробиологическая (бактериологическая) лаборатория (или бакотдел в составе производственной лаборатории мясоперерабатывающего предприятия) предназначена для санитарно-бактериологического контроля сырья, готовой продукции, вспомогательных материалов, санитарно-гигиенического состояния технологического оборудования, инвентаря, тары, одежды и рук персонала.

Помещения лаборатории. Общее размещение лаборатории и её инфраструктура должны соответствовать требованиям ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). В лаборатории предусматриваются следующие отдельные помещения или изолированные рабочие зоны:

для приема, хранения, подготовки и обработки проб;

для проведения первичного посева, пересева, приготовления разведений и других работ в асептических условиях;

для приготовления, стерилизации, розлива и хранения питательных сред, подготовки лабораторной посуды и оборудования;

для обеззараживания и очистки оборудования, отработанных питательных сред и контаминированных микрофлорой материалов.

Термостаты, холодильники, морозильники могут быть расположены в отдельных комнатах.

Помещения необходимо располагать так, чтобы обеспечить защиту их от влияния внешних факторов (повышенная температура, влажность, запыленность, шум, вибрация), организовать поточность прохождения чистых и зараженных материалов.

Мясо может быть обсеменено патогенной микрофлорой, представляющей серьезную опасность для здоровья людей, и помещения лаборатории должны быть изолированы от других отделов. Если нет возможности организовать отдельную комнату, допускается в общем помещении установить стол для проведения первичного посева проб. Целесообразно оборудовать застекленный бокс с предбоксником для обеспечения асептических условий работы.

Лабораторные комнаты должны быть светлыми (освещенность поверхности столов в пределах 500 лк) и просторными – для каждого аналитика рекомендуемая площадь рабочего места около 20 м. Стены, потолок и пол должны быть гладкими, легкоочищаемыми, устойчивыми к действию детергентов и дезинфицирующих веществ. Для удобства очистки и дезинфекции поверхность лабораторного инвентаря и мебели покрывают гладким непроницаемым материалом, например пластиком, а рабочее место - зеркальным столом.

Для бактериологического анализа пищевых продуктов, в частности колбасных изделий и копченостей, необходимы 1-2 бокса с предбоксниками. Боксы представляют собой изолированные, защищенные от пыли остекленные комнаты; максимально допустимое количество частиц размером более 0,5 мкм в 1м не должно превышать 4000.

В помещениях лаборатории регулярно проводят уборку и дезинфекцию, качество которых периодически контролируют микробиологическим методом.

В каждом помещении должны быть холодное и горячее водоснабжение, бутыль с дезинфицирующим раствором для мытья рук.

1.3 Правила работы в микробиологической

лаборатории

Непосредственный контакт с микроорганизмами и необходимость соблюдения стерильных условий при проведении всех операций требуют знания и неукоснительного соблюдения следующих правил:

работать в халатах;

поддерживать чистоту и порядок на рабочем месте;

не касаться пальцами микробных налетов и конденсационной воды в пробирках и чашках с посевами;

не стирать микробных налетов с предметных и покровных стекол и других объектов салфетками, фильтровальной бумагой, дезинфицировать их, помещая в спирт или раствор карболовой кислоты;

в процессе работы и после проведения посевов уничтожать остатки микробных налетов на бактериологических иглах и петлях прокаливанием в пламени спиртовки или газовой горелки;

обезвреживать использованные загрязненные материалы и отработанные культуры микробов стерилизацией в автоклаве (эту работу выполняют сотрудники лаборатории);

не держать спиртовки близко к лицу, зажигать спиртовку только спичкой;

убрать и обработать рабочее место по окончании работы дезинфицирующим раствором под контролем лаборанта; поместить культуры микроорганизмов, необходимые для дальнейшей работы, в холодильник или сейф, который закрывают и пломбируют; поставить в термостат засеянные микрофлорой пробирки и чашки Петри;

мыть тщательно руки по окончании работы, не принимать пищу в лаборатории.

1.4 Устройство оптического микроскопа и уход за ним.

Микроскоп – сложный оптический прибор, увеличивающий предмет в 1000 – 1500 раз. Современный микроскоп состоит из двух основных частей – механической и оптической.

Механическая часть состоит из штатива, в котором различают ножку, основание, тубусодержатель, и предметного столика, прикрепляемого к основанию штатива. Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного и наблюдательного аппаратов.

Осветительный аппарат расположен под предметным столиком и состоит из зеркала, конденсора и ирис-диафрагмы.

Зеркало отражает световые лучи и направляет их к конденсору.

Конденсор представляет собой систему линз и служит для усиления яркости освещения рассматриваемого объекта.

К наблюдательному аппарату относят объективы и окуляры.

Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя или фронтальная линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе – коррекционные.

Биологические микроскопы МБР-1 и МБИ-1 обычно имеют три, четыре объектива с цифровыми обозначениями х8, х20, х40, х90, показывающими собственно увеличение этих объектов.

Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Окуляр представляет собой систему двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклостью в сторону объектива. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, обращенная к препарату – собирающей. Окуляры отечественных микроскопов помечаются цифрами, показывающими их собственное увеличение: х5, х7, х10, х15.

Степень увеличения микроскопа равна произведению степени увеличения окуляра на степень увеличения объектива.

Правила ухода за микроскопом:

Микроскоп предохраняют от попадания пыли, влаги и солнечных лучей. После работы с ним его помещают в футляр или накрывают колпаком из плотной ткани.

Объективы и окуляры протирают замшей или фланелью.

Тубус микроскопа не оставляют открытым, т. е. без окуляра, так как это приводит к накапливанию пыли в тубусе и загрязнению объективов.

Микроскоп состоит из двух основных частей. Основой микроскопа является штатив. К нему прикреплен тубус с заключенной в нем оптической частью и предметный столик. Штатив состоит из основания (или подковообразной ножки) и тубусодержателя. Тубусодержатель соединяется с основанием шарниром, что позволяет верхнюю часть микроскопа устанавливать в наклонное положение для облегчения работы. В тубус помещают объективы и окуляры. Объективы ввинчиваются в нижнюю часть тубуса, называемую револьвером. Окуляры свободно вкладываются в верхнюю часть тубуса. Увеличение можно изменить путем применения различных объективов, которые ввинчивают во вращающийся барабан револьвера.

Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта. Чтобы препарат был ясно виден, тубус при помощи механизмов грубого или микрометрического движения необходимо передвигать в направлении его оптической оси. Грубое движение должно осуществляться достаточно легко, но без самопроизвольного опускания тубуса. Для более точной установки служит микрометрический винт. Микрометрический винт имеет сложную конструкцию, является одной из наиболее легко повреждающихся частей микроскопа. Нельзя поворачивать винт более чем на пол-оборота в ту или иную сторону (после грубой установки микроскопа). Предметный столик служит для помещения исследуемого препарата.

Оптическая часть состоит из зеркала, конденсора с диафрагмой, объективов и окуляров. Зеркало микроскопа подвижное. При искусственном свете лучше пользоваться вогнутым зеркалом, при рассеянном свете – плоским. Зеркало отражает световые лучи и направляет их к конденсору. Конденсор применяется для получения более сильного освещения препарата. Диафрагма служит для регулирования освещенности препарата. Диафрагма находится между нижней поверхностью конденсора и зеркалом.

Объективы – наиболее важная часть микроскопа, определяющая его оптическую мощность. Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя или фронтальная линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе коррекционные. Окуляры увеличивают изображение, даваемое объективом, но не выявляют каких-либо деталей исследуемого препарата.

Объективы, которые при работе нужно погружать в кедровое масло, называют иммерсионными, или погружными. Сухой объектив – это объектив, у которого между препаратом и линзой находится воздух. Каждый микроскоп снабжен сухими и иммерсионными объективами. Объективы с собственным увеличением 8 и 40 являются сухими, объектив с собственным увеличением 90 – иммерсионный.

Правила работы с микроскопом МБР-1

1. Микроскоп хранят в шкафу для защиты от пыли, влаги и света. Переносят микроскоп правой рукой, держась за ручку штатива, левой поддерживают снизу.
2. Приступая к работе с микроскопом окуляр, объектив и зеркало протрите салфеткой.
3. Установите микроскоп штативом к себе, предметным столиком от себя. По отношению к сидящему микроскоп должен быть сдвинут ближе к левому плечу. Справа от микроскопа располагают альбом, простой и цветные карандаши, ластик.
4. Поставьте в рабочее положение объектив малого увеличения. Для этого поворачивайте револьвер до тех пор, пока нужный объектив не займет срединное положение (встанет над отверстием столика). Когда объектив занимает срединное положение, в револьвере срабатывает специальное устройство – защелка, при этом слышится легкий щелчок и револьвер фиксируется. Запомните, что изучение любого объекта начинается с малого увеличения.
5. Поднимите с помощью макрометрического винта объектив над столиком примерно на 1 см. Откройте диафрагму, поднимите конденсор до уровня предметного столика.
6. Глядя левым глазом в окуляр, при помощи зеркала наведите свет так, чтобы все поле зрения было освещено ярко и равномерно.
7. Положите на предметный столик, приготовленный препарат покровным стеклом вверх, чтобы объект находился в центре отверстия предметного столика. Опустите с помощью макрометрического винта объектив над препаратом на 0,2 см.
8. Смотрите в окуляр, одновременно медленно поворачивайте кремальеру на себя и плавно поднимайте тубус до тех пор (0,5 см), пока в поле зрения не появится изображение объекта; осторожно вращая микрометрический винт не более чем на ½ или ¾ полного оборота, добейтесь четкой видимости.
9. Переходя к рассмотрению объекта при большом увеличении, необходимо центрировать препарат, т.е. поместить интересующую часть объекта в самый центр поле зрения. Для этого передвигайте препарат с помощью препаратоводителей или руками, пока объект не займет нужного положения. Если объект не будет центрирован, то при большом увеличении он останется вне поля зрения.
10. Переходя с меньшего на большее увеличение, поворотом револьвера поставьте объектив большего увеличения против нижнего отверстия тубуса. Смотрите в окуляр и, осторожно вращая микрометрический винт, добейтесь четкого изображения.
11. При зарисовке препарата смотрите в окуляр левым глазом, а правым в альбом.
12. После работы с использованием микроскопа при помощи револьвера замените объектив большого увеличения на объектив малого, снимите со столика препарат и поставьте его на место.
13. Уберите за собой рабочий стол; препараты и методические указания на стол преподавателя.

1.5 Основные формы бактерий.

По форме бактерии принято делить на шаровидные (кокки), палочковидные (клостридии, бациллы) и извитые (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Кокковидные формы по расположению кокков подразделяются на микрококки – клетки, расположенные одиночно; диплококки – кокки, соединенные по два; тетракокки – кокки, соединенные по четыре; стрептококки – кокки, расположенные в виде длинной или короткой цепочки; сарцины – кокки, расположенные в виде пакетов; стафилококки – беспорядочное скопление кокков, чаще в виде гроздьев винограда.

Палочковидные формы по расположению палочек подразделяют на диплобактерии – палочки, соединенные попарно; стрептобактерии – палочки, расположенные в виде цепочки. Среди спорообразующих различают бациллы и клостридии. У бацилл диаметр спор не превышает ширины вегетативной клетки, а у клостридий – спора больше ширины клетки, поэтому клетка принимает форму веретена, теннисной ракетки, барабанной палочки.

Извитые формы подразделяют на вибрионы, имеющие формы запятой, спириллы, имеющие несколько (до 5) завитков, и спирохеты с большим количеством мелких завитков.

Порядок выполнения

2. Микроскопия готовых препаратов с основными формами бактерий .

Техника микроскопирования.

На предметный столик помещают исследуемый препарат и закрепляют клеммами.

При работе с иммерсионным объективом 90 на препарат наносят каплю иммерсионного масла, а затем с помощью макрометрического винта осторожно опускают тубус с центрированным объективом 90 так, чтобы его фронтальная линза погрузилась в каплю масла, а фокус был ниже препарата. Затем, глядя в окуляр, тем же винтом очень медленно поднимают тубус (на сотые доли миллиметра), пока не увидят изображение микробов. Точную установку препарата в фокус объектива производят с помощью микрометрического винта.

Примечание.

Достоинством иммерсионной системы является то, что при погружении объектива в масло, лучи света, проходящие через среды стекло-масло, почти не преломляются, так как показатель преломления света для этих сред почти одинаков. В результате этого освещенность при микроскопировании с маслом максимальна.

По окончании работы удаляют салфеткой из мягкой ткани иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива 90, для более полного удаления масла фронтальную линзу протирают салфеткой, смоченной смесью спирта и эфира в пропорции 1:1, затем протирают объектив досуха. Микроскоп помещают на хранение.

При микроскопировании обратить внимание на форму и размер клеток изучаемого микроорганизма, на особенности строения клеток – наличие спор и капсул у бактерий, почек – у дрожжей; в препарате плесеней – на разнообразие форм клеток: круглые, овальные, вытянутые, цилиндрические, ветвистые.

Отчет по результатам микроскопирования .

Результаты микроскопирования заносятся в таблицу (форма1).

Форма 1

Контрольные вопросы.

1. Каким оборудованием должна быть оснащена микробиологическая лаборатория, его назначение?
2. Основные правила работы в микробиологической лаборатории.
3. Каково устройство оптической системы биологического микроскопа?
4. Какие правила необходимо соблюдать при пользовании и уходе за микроскопом?
5. Какие основные формы бактерий вы знаете?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2.

Приготовление микробиологических препаратов для изучения живых микроорганизмов («раздавленная капля» и «висячая капля»). Приготовление мазков из микробных культур.

Любая работа по приготовлению препаратов микроорганизмов, так же как и по пересевам микроорганизмов, проводится с соблюдением правил асептики.

Оборудование лабораторного стола.

Для работы с микроорганизмами требуется определенное оборудование. На рабочем лабораторном столе должны быть спиртовка или газовая горелка, бактериологическая петля, предметные и покровные стекла, набор красок, микроскоп, салфетка, кедровое масло, пинцет, кювета с мостиком, сосуд с водой, песочные часы, карандаш по стеклу, фильтровальная бумага.

Цель занятия .

Ознакомиться с методами исследования бактерий на подвижность.

Материальное обеспечение.

Молодые бульонные культуры микроорганизмов в пробирках для исследования на подвижность, предметные и покровные стекла, предметные стекла с луночкой, бактериологические петли, пастеровские пипетки, микроскопы, спички, спиртовые или газовые горелки.

Преподаватель должен продемонстрировать технику приготовления неокрашенных препаратов микроорганизмов, подготовку микроскопа к работе, регулирование освещенности поля зрения, установку увеличителя, технику микроскопирования препаратов.

Во время работы студентов преподавателю следует постоянно проверять освещенность поля зрения в каждом микроскопе, в необходимых случаях помочь отрегулировать ее и посмотреть изображения найденных объектов. Просмотру неокрашенного препарата следует уделить особое внимание, так как студенты должны видеть здесь и форму клеток, и их подвижность.

Задания.

1. Приготовить препараты «раздавленная и висячая капля» для определения подвижности бактерий.
2. Приготовить мазок из микробной культуры.
3. Изучить технику микроскопирования и посмотреть приготовленные препараты под микроскопом.
4. Составить отчет по результатам микроскопирования.
5. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Порядок выполнения

1. Исследование подвижности микробов в препаратах «раздавленная и висячая капля».

Раздавленная капля.

Если организмы находятся в жидкой среде, капля суспензии наносится на обезжиренное предметное стекло с помощью стерильной пипетки. (Пипетка после употребления сразу же помещается в фарфоровый стакан с дезинфицирующим раствором. Класть грязную пипетку на рабочий стол недопустимо!). Если же культура выращена на твердой питательной среде, то на стекло предварительно наносят каплю воды, а затем помещают в неё клетки микроорганизмов или исследуемую пробу тестируемого продукта бактериологической петлей, прокаленной в пламени горелки, и тщательно размешивают.

Каплю жидкости накрывают покровным стеклом. Чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха, покровное стекло сначала ставят на предметное стекло одним ребром, а затем плавно опускают, прижимая «раздавливая» при этом каплю. Желательно избегать избытка жидкости, чтобы суспензия микроорганизмов не выдавливалась из-под покровного стекла. Если это произошло, лишнюю жидкость удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Использованную бумагу следует сразу же поместить в дезинфицирующий раствор.

Для микроскопирования препарата «раздавленная капля» используют только объективы с сухой системой, то есть без иммерсии. Этот вид препарата позволяет установить форму клеток, их размер, способ спорообразования, а если клетки живые, то и наличие или отсутствие подвижности.

Достоинство препарата – получается тонкий слой жидкости, где можно увидеть живые организмы.

Недостаток – быстро высыхает, и движение прекращается, часто попадает воздух, что нарушает микроскопическую картину.

Для приготовления препарата « висячая капля » на покровное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Если предстоят многодневные наблюдения, то края лунки смазывают вазелином и капля оказывается герметически заключенной во влажной камере. Препарат «висячая капля» используют для выявления подвижности у микроорганизмов, изучения способов размножения, наблюдения за прорастанием спор.

Для приготовления препарата-мазка исследуемую культуру микроба осторожно распределяют равномерным тонким слоем на предметном стекле. При приготовлении культур выросших на плотных средах, поступают следующим образом. На чистое предметное стекло стерильной пипеткой или бактериологической петлей наносят каплю стерильной водопроводной воды или физиологического раствора.

а) Берется пробирка с культурой, из которой необходимо приготовить мазок. Бактериологическую петлю прокаливаем в пламени горелки, держа её в вертикальном положении.

б) Зажав пробку между мизинцем и ладонью правой руки, вынимаем её из пробирки и держим концом вниз, не допуская соприкосновения с рукой той части пробки, которая находилась в пробирке.

в) Открытый конец пробирки обжигаем на пламени.

г) Вводим в пробирку петлю (ещё раз проведенную через пламя), охлаждаем прикосновением к стенке пробирки и набираем небольшое количество материала, слегка прикасаясь к культуре и не царапая среду петлей.

д) Края пробирки и конец ватной пробки обжигаем над пламенем горелки.

е) Пробирку закрываем ватной пробкой.

ж) Взятый материал эмульгируют в имеющийся на предметном стекле капле и равномерно тонким слоем петлей распределяют по поверхности (1,5 х 2 см).

з) Петлю прокаливают и кладут на место.

Если культура выращена в жидкой питательной среде, то стерильную петлю опускают в жидкость, захватывают каплю и растирают на предметном стекле.

3.Техника микроскопирования .

Помещают микроскоп на рабочем столе от края на 3-5 см тубусодержателем к себе.

Устанавливают хорошее равномерное освещение поля зрения микроскопа, для чего, глядя в окуляр, зеркалом направляют луч света от источника в объектив. Конденсор должен быть поднят вверх, а диафрагма открыта. Поле зрения микроскопа должно быть хорошо и равномерно освещено во всех точках.

На предметный столик помещают исследуемый препарат мазком или каплей вверх и закрепляют клеммами.

Неокрашенные препараты микроскопируют с объективами х8 и х40, опуская конденсор на 1- 0,5 см до препарата, добиваются наилучшей видимости неокрашенных клеток.

При микроскопировании «живых» микробов (неокрашенный препарат) отметить подвижность.

4.Отчет по результатам микроскопирования.

в) рисунок клеток под микроскопом (указать наличие спор, капсул, почек, подвижность).

5.Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какова техника приготовления препаратов «раздавленная и висячая капля»?
2. Какова методика приготовления мазка из культуры бактерий, выращенных на плотной питательной среде?
3. Что позволяет установить препарат «раздавленная капля»?
4. Для каких исследований используют препарат «висячая капля»?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3.

Приготовление окрашенных препаратов бактерий.

Цель занятия.

Научиться готовить и окрашивать бактериальные препараты простым методом и по методу Грама.

Материальное обеспечение.

Набор готовых растворов красок во флаконах, набор сухих красок во флаконах или в пробирках с резиновыми или корковыми пробками: основной и кислый фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, сафранин, малахитовая и бриллиантовая зелень, смесь микробов: культуры грамположительных бактерий (Bac. subtilis, Staph. saprophyticus), грамотрицательных микробов (E. coli), выращенных на скошенном МПА, предметные стекла, раствор водного фуксина (фуксин Пфейффера), бактериологические петли, фильтровальная бумага, микроскопы, спиртовые или газовые горелки.

Преподаватель должен продемонстрировать технику приготовления окрашенных препаратов микроорганизмов, подготовку микроскопа к работе, регулирование освещенности поля зрения, установку увеличителя, технику микроскопирования препаратов.

Во время работы студентов преподавателю следует постоянно проверять освещенность поля зрения в каждом микроскопе, в необходимых случаях помочь отрегулировать её и посмотреть изображения найденных объектов. При просмотре окрашенного препарата студент должен видеть наличие спор и капсул у микроорганизмов.

Задания.

1. Приготовить мазок из зубного налета и окрасить простым методом.
2. На одном предметном стекле приготовить мазок из смеси стафилококка и кишечной палочки и окрасить по Граму.
3. Просмотреть с иммерсионным объективом окрашенные мазки.
4. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Ответить на контрольные вопросы.

Пояснение к работе

Для изучения формы микробной клетки и некоторых её структур препарат (мазок) из материала, содержащего исследуемый микроб, окрашивают.

Большинство микробов быстро и хорошо окрашиваются растворами анилиновых красителей. По химическим свойствам их принято делить на основные и кислые. У основных красителей хромофором (ион, придающий окраску) является катион, у кислых – анион.

К основным красителям относятся красные – нейтральный красный, фуксин основной, сафранин, тионин, пиронин, гематоксилин; синие – метиленовый синий; фиолетовые – кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый; зеленые – малахитовый зеленый, метиленовый зеленый. Основные красители, как правило, легко связываются с ядерными (кислыми) компонентами клеток.

К кислым красителям относятся красные и розовые – фуксин кислый, эозин; желтые – пикриновая кислота, конго, флуоресцен; черные – нигрозин. Кислые красители более интенсивно окрашивают (основные) компоненты клеток.

Приготовление рабочих растворов красок. Прежде чем приготовить рабочие растворы красок, предназначенные для окрашивания микробов, часто заблаговременно из сухих красок, предназначенные для окрашивания микробов, часто заблаговременно из сухих красок готовят насыщенные спиртовые растворы. Для этого краску заливают 96%-ным спиртом в соотношении 1:10. При таком соотношении спирт насыщается краской (нерастворенная часть красок выпадет в осадок). С целью экономии рекомендуется брать на 100 см³ спирта метиленового синего 7,0, генцианвиолета 4,8, основного фуксина 8,1.

Для лучшего насыщения спиртовые растворы помещают в термостат и выдерживают до полного растворения красок. Из насыщенных спиртовых растворов по мере надобности готовят водные рабочие растворы.

Наиболее часто употребляют следующие растворы красителей:

Карболовый раствор фуксина Циля. К 100 мл 5%-го раствора кристаллической карболовой кислоты добавляют 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина основного. Насыщенный раствор фуксина получают при смешивании 8 г кристаллов фуксина в 10 мл спирта. Краска имеет красный цвет.

Фуксин Пфейффера представляет собой карболовый раствор фуксина Циля, разведенный в дистиллированной воде 1:10. Готовится непосредственно перед использованием. Краска имеет насыщенный розовый цвет.

Карболовый раствор генцианвиолета. К 10 мл насыщенного спиртового раствора краски добавляют 100 мл 2%-го водного раствора карболовой кислоты. Насыщенный раствор получают, растворяя 1г кристаллического генцианвиолета в 10 мл 96%-ного спирта. Краска имеет сине-фиолетовый цвет.

Сафранин. Готовят непосредственно перед использованием, добавляя к 100 мл горячей воды 1г сафранина. Краска имеет красно-коричневый цвет.

Метиленовая синяя (синька Леффлера). Готовят, добавляя к 100 мл дистиллированной воды 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1%-го водного раствора КОН или NaOH. Раствор имееи темно-синий цвет.

Малахитовая зелень. 1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют. Раствор имеет сине-зеленый цвет.

Раствор Люголя. Берут 1г кристаллического йода и 2г йодистого калия на 300 мл дистиллированной воды. Сначала в небольшом количестве воды растворяют йодистый калий, а затем прибавляют кристаллы йода. После полного растворения добавляют остальную дистиллированную воду.

Сложные способы окраски применяют для детального изучения структуры клетки, а также для дифференциации одних микроорганизмов от других. Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения клетки и её частей. Наибольшее практическое знание имеет окраска по Граму, позволяющая дифференцировать бактерии по химическому составу и структуре клеточной стенки.

Метод был разработан датским ученым Христианом Грамом в 1885 г. При окраске по методу Грама все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

Порядок выполнения

Методика окраски по Граму.

1.Метод простой окраски. При простом методе окраски используется один какой-нибудь красящий раствор, чаще всего фуксин Пфейффера или метиленовый синий.

На фиксированный препарат помещают пипеткой несколько капель красящего раствора так, чтобы покрыть всю поверхность мазка: фуксин Пфейффера на 1-2 мин, метиленовый синий на 3-5 мин. Затем краску смывают водой, а мазок просушивают между листочками фильтровальной бумаги или на воздухе.

2.Сложные методы окраски применяют с целью диагностики, выявления отличительных структур микробов в случаях, когда последние не окрашиваются простым способом.

Для дифференциации микробных клеток, различающихся химическим составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод окраски – окраска по Грамму.

По окраске по Грамму все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

У грамположительных бактерий (Г+) толщина клеточной стенки составляет 15-80 нм, состоит из пептидогликана (от 60-90%), расположенного в несколько слоев, белка (около 1%) и липидов (около 1%). Обнаружены полимеры особого типа – тейхоевые кислоты, ковалентно связанные с пептидогликаном. Большое содержание пептидогликана обеспечивает при окраске по Граму образование комплекса с генциановым фиолетовым и йодом, устойчивого к спирту, вследствие чего они окрашены в сине-фиолетовый цвет.

Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий (Г-) 10-15 нм, но структура её значительно сложнее, чем у грамположительных бактерий. Основу её составляют ориентированные внутренние липиды (10-20%), которые с поверхностно расположенными полисахаридами образуют липополисахаридный слой. На поверхности клеточной стенки мозаично расположены белки и полисахариды. Пептидогликан представлен одним слоем толщиной всего 2-3 нм (около 5-10%), лежит под липополисахаридным слоем и плотно прикрывает протопласт. Из-за большего содержания липидов клеточная стенка грамотрицательных бактерий при окраске по Грамму образует с генциановым фиолетовым и йодом комплекс, разрушаемый при обработке спиртом, вследствии чего клетки обесцвечиваются.

Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму связано с различиями в структуре и химическом составе клеточной стенки бактерий.

К грамположительным микроорганизмам относятся кокки, бациллы (спорообразующие палочки), актиномицеты, микобактерии, клостридиальные бактерии.

К грамотрицательным микроорганизмам относятся: бактерии (неспорообразующие палочки), спириллы, сальмонеллы, E coli, псевдомонады, азотбактер, вибрионы.

Имеются грамвариабельные микроорганизмы, отношение которых к окраске по Граму меняется на определенных этапах их жизненного цикла. Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста, для окраски по Граму используют клетки молодой культуры, чаще односуточной. Для сравнения одновременно с определяемым объектом целесообразно окрашивать клетки микроорганизмов, отношение которых к окраске по Грамму известно (контроль).

Окраску по Грамму осуществляют следующим образом:

1. Готовят на предметном стекле три мазка культуры микроорганизмов: в центре – мазок исследуемой культуры, слева и справа – мазки контрольных микроорганизмов.

Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки равномерно были распределены по поверхности стекла и не образовывали скоплений, так как от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания. Высушивают мазки на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

1. Окрашивают мазки карболовым генциановым фиолетовым. На мазки наносят достаточное количество красителя, выдерживают 1-2 мин, краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором Люголя до почернения (приблизительно 1-2 мин).
2. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0,5-1 мин (строго) 96%-ным этиловым спиртом путем погружения в стаканчик со спиртом или путем нанесения спирта на мазки (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработке все бактерии сохраняют окрашивание, при чрезмерной – обесцвечиваются).
3. Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1-2 мин водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
4. Микроскопируют препарат с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваютя в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный или розовый цвет фуксина (цвет дополнительного красителя).

Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов (по Крегенсену).

Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде и определении свободной ДНК.

На предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора КОН, в которую вносят бактериальной петлей исследуемые бактерии (24-часовая культура со скошенного агара) и хорошо перемешивают петлей.

Через 5-10 с при передвижении петли по стеклу при положительной реакции в результате тестирования грамотрицательных бактерий образуется слизистый след длиной 1-2 см. Если слизь не образуется, то реакция отрицательная, тогда тестируется грамположительная культура.

3. Отчет по результатам микроскопирования.

а) система микроскопирования;

б) микроскопируемая культура;

в) рисунок клеток под микроскопом (указать наличие спор, капсул).

4. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какие растворы красителей используют при простом методе окраски?
2. Опишите методику окраски бактерий по Граму.
3. Почему бактерии по разному воспринимают окраску по методу Грама?
4. Какие бактерии относятся к грамположительным, а какие к грамотрицательным ?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4

Питательные среды и техника их приготовления.

Цель занятия.

Овладеть техникой приготовления питательных сред.

Материальное обеспечение.

Сухие питательные среды, среды, готовые к употреблению, электроплитка, посуда для варки сред, индикаторная бумага, 20%-ный едкий натр, 20%-ная соляная кислота, пробирки, пипетки, чашки Петри.

Перед выполнением работы студенты повторяют вопросы питания микроорганизмов, питательные среды, классификацию питательных сред, основные требования к питательным средам.

При выполнении лабораторной работы студенты готовят питательную среду.

Задания.

1. Ознакомиться с пояснением к работе.
2. Приготовить питательную среду (по заданию преподавателя).
3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Ответить на контрольные вопросы.

Пояснение к работе

В бактериологических лабораториях нельзя обойтись без питательных сред. Для определения вида микроорганизма, обнаружения возбудителя инфекционной болезни, т. е. установления диагноза заболевания, производства специфических препаратов (вакцин, сывороток), для лечения и профилактики инфекционных болезней, получения антибиотиков, санитарно-микробиологических исследований объектов внешней среды, бактериологического исследования мяса и мясных продуктов прибегают к искусственному выращиванию микроорганизмов на питательных средах.

В лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных пробирках, колбах или других сосудах. Для культивирования in vitro необходимы субстраты, которые микроорганизмы используют в качестве питательных веществ.

По потребности в питательных веществах все микроорганизмы можно разделить на три группы:

первая группа - неприхотливые, растущие на простых средах (гнилостные, большинство кокковых и других микроорганизмов);

вторая группа - требующие для своего роста дополнительных питательных веществ: полноценного белка (куриного или сывороточного), витаминов, определенного набора аминокислот, микроэлементов (туберкулезная, туляремийная палочки, лептоспиры и др.);

третья группа – не растущие на искусственных питательных средах, а способные размножаться только внутри живых клеток (вирусы, риккетсии).

К питательным средам предъявляют следующие требования:

1. Они должны содержать источники азота и углерода, неорганические соединения, микроэлементы, а также факторы роста, витамины, в основном группы В.

В качестве универсального источника азота используют пептоны. Пептоны – это продукты гидролизного расщепления мяса или казеина. В них содержатся полипептиды, аминокислоты и основные минеральные вещества.

В качестве универсального источника углерода в питательные среды добавляют углеводы (сахара) – глюкозу, лактозу, сахарозу, органические кислоты – молочную, лимонную и др., многоатомные спирты – маннит, глицерин, сорбит и др.

2. Питательные среды должны иметь определенную реакцию среды. Так, для большинства кокковых, гнилостных и патогенных микроорганизмов оптимум рН 7,0…7,4, а плесневые грибы, дрожжи, молочнокислые микроорганизмы лучше развиваются при рН 6,0.

3. Питательная среда должна быть стерильной, т.е. не содержать микроорганизмов.

4. Питательная среда должна быть влажной, так как питание у микроорганизмов осуществляется по законам диффузии и осмоса. Многие среды должны быть прозрачными для того, чтобы можно было различить на них рост микроорганизмов и наблюдать за физиологическими изменениями, происходящими в результате их жизнедеятельности.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие и плотные. Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар 2…3%-ной концентрации, для полужидкой – агар-агар 0,2…0,3%-ной концентрации.

По происхождению различают среды естественные и искусственные.

Естественные питательные среды представляют собой продукты животного происхождения (кровь, сыворотка крови, молоко, желчь …) или растительного происхождения (овощи, фрукты, злаковые), которые используют для культивирования микроорганизмов без специальной обработки с полным сохранением их естественных свойств.

Искусственные питательные среды готовят из продуктов переработки растений, мяса, молока, печени и др., часто с добавлением к ним углеводов, поваренной соли, красок и т.п.

Среди искусственных сред выделяют синтетические среды, т.е. среды с точно известным химическим составом. Искусственные питательные среды подразделяются на простые, или обычные, и сложные.

Простые питательные среды служат для культивирования большинства микроорганизмов. Белковой основой всех сред является питательный бульон. Обычно пользуются двумя способами приготовления основного питательного бульона: на мясной воде с добавлением готового пептона – мясопептонный бульон, на переварах продуктов гидролиза исходного сырья с помощью ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислот, такие среды богаче аминокислотами.

От азотистого состава мясопептонных сред и от степени расщепления белка в мясных и других гидролизатах зависит содержание в среде общего и аминного азота.

Для хорошего роста большинства микроорганизмов необходимо содержание в 100 см бульона не менее 250 … 300 мг общего азота при наличии в этом количестве аминного азота (аминокислот) в среднем около 25…30%.

Наиболее распространенными простыми питательными средами являются мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный желатин (МПЖ).

Мясопептонный агар (МПА) – используют для определения общего количества микроорганизмов.

Основой для всех трех сред является мясная вода, которую готовят из фарша говядины, залитого водой и сваренного в течение 1,5 … 2 часов, профильтрованного и простерилизованного в течение 20 …30 минут при 120˚С.

Мясо-пептонный бульон. К 1л мясной воды добавляют 1% пептона и 0,5% поваренной соли, подщелачивают 10%-ным раствором NaOH до рН 7,4, фильтруют и стерилизуют в течение 15 …20 мин при давлении 0,1 МПа.

Мясо-пептонный агар. К мясо-пептонному бульону добавляют мелко измельченный агар-агар (2…3%), нагревают смесь до расплавления агара, устанавливают рН до 7,2…7,6, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и колбам стерилизуют в течение 20…30 мин при 120˚С.

При необходимости МПА разогревают на водяной бане до полного расплавления. Пробирки укладывают в специальные штативы под углом 10˚ и после застывания получают так называемый скошенный агар, который используют для посевов микроорганизмов. Расплавленный мясо-пептонный агар разливают также в чашки Петри.

Аналогично готовят мясо-пептонный желатин.

Порядок выполнения

2. Приготовление питательной среды из готовой сухой питательной среды.

Сухие питательные среды. Выпускаются простые, элективные и дифференциально-диагностические сухие питательные среды. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, легко растворяющиеся в воде. Сухие питательные среды выпускаются в стеклянных банках с плотно завинчивающимися крышками.

Такие среды готовят согласно инструкции, растворяя порошок в указанном количестве дистиллированной воды, фильтруют и стерилизуют при температуре 120˚С в течение 20 мин.

Сухой питательный агар готовят следующим образом: к растворенному сухому агару (5 г агара на 100 мл) добавляют в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого экстракта, мясной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин.

3. Записать содержание занятия в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные требования к питательным средам?
2. Какие наиболее употребляемые питательные среды, предназначенные для культивирования микроорганизмов, их назначение?
3. Какие компоненты входят в состав простых питательных сред?

Список используемой литературы

1. Градова Н. Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии – М.: ДеЛи принт, 2010.
2. Мармузова Л. В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности – М.: 2005.
3. Мудрецова-Висс К. А. Микробиология, санитария и гигиена – М.: ДЛ, 2010.

«Основы микробиологии, санитарии и гигиены».

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным работам №№1-4

для учащихся профессии НПО

34.17 Оператор процессов колбасного производства.

__________________________________________________________________

Жукова Любовь Анатольевна, преподаватель специальных дисциплин ГАОУ СПО города Москвы ТК № 28

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

Технологический колледж № 28

Адрес: Москва, ул. Верхние поля, 27

Сдано в печать 07.02.2012.

Формат бумаги 60х90/16

Тираж 16 экз.

Отпечатано в типографии:

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования города Москвы

ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ

В. Н. КИСЛЕНКО

ПРАКТИКУМ

ПО ВЕТЕРИНАРНОЙ

МИКРОБИОЛОГИИ

И ИММУНОЛОГИИ

Допущено Министерством сельского хозяйства РФ в

качестве учебного пособия для студентов высших

учебных заведений, обучающихся по специальности

«Ветеринария»

МОСКВА «КолосС» 2005

УДК 619: 579(075.8) ББК 48я73 К44

Редактор Т.С. Мояочаева
Рецензенты: доктор ветеринарных наук, профессор В. И. Плешакова (Ин­ститут веете

ринарной медицины Омского ГАУ); доктор ветеринарных наук, про­фессор IT . И. Ба

рышников (Институт ветеринарной медицины Алтайского ГАУ)

Кисленко В. Н.

К44 Практикум по ветеринарной микробиологии и иммуно­логии. - М.: КолосС, 2005.- 232 с. л.: ил. - (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений). ISBN 5-9532-0332-2

Практикум состоит из двух разделов. Раздел «Общая микробиология» содержит сведения о правилах работы в бактериологической лаборатории, описание основных микробиологических, генетических и иммунологичес­ких методов изучения микроорганизмов. В разделе «Возбудители инфек­ционных болезней» перечислены методы лабораторной диагностики, диф­ференциации возбудителей и дан перечень применяемых биопрепаратов.

Приведены методические указания к проведению практических заня­тий для преподавателей.

Прилагаются комплекты тестов на электронном носителе (CD-диске) по общей и частной микробиологии, иммунологии, а также по теоритичес­кому курсу.

Для студентов высших учебных заведений по специальности «Ветери­нария».

ВВЕДЕНИЕ

Основная задача ветеринарных лабораторий - установление точного диагноза болезней сельскохозяйственных животных, включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел, а также проведение экспертизы мяса, молока и других пищевых продуктов животного и растительного происхождения. В лабораториях также выполня­ют научные работы, осуществляют производство некоторых био­стимуляторов, антибиотиков и др.

Материалом для лабораторных исследований служат кровь, моча, мокрота, молоко, фекалии, содержимое абсцессов (гной), полученные при жизни животного; кусочки паренхиматозных ор­ганов или других тканей после их гибели, пробы объектов окружа­ющей среды (вода, воздух, почва, корма, растения, смывы с пред­метов ухода). Материал в лаборатории исследуют бактериологи­ческими, серологическими, гистологическими, биохимическими, микологическими и токсикологическими методами, для чего дол­жны быть созданы необходимые условия (специально отведенные помещения, оборудование, микроклимат и др.).

Лаборатория занимает отдельное здание, расположение вдали от проезжих дорог. В ней должны быть приемное отделение, пато-логоанатомический, бактериологический, серологический, биохи­мический и вирусологический отделы, а также специальные по­мещения для термостатов, мытья посуды, автоклавная. В комнате для мытья посуды находятся столы, раковины, горячее и холодное водоснабжение, газовая или электрическая плита, стеллажи для вымытой посуды, вытяжной шкаф, эмалированные ванны, тазы и другие емкости, раствор кислоты в стеклянных сосудах для обезза­раживания пипеток, предметных стекол и другой посуды. Отдель­ное помещение отводят под бактериологическую кухню (средова-рочная), где готовят питательные среды для культивирования микроорганизмов, подготавливают посуду для стерилизации. Здесь же в шкафах хранят стерильную посуду и хорошо упакован­ные химические вещества, компоненты питательных сред.

Для выполнения работы в асептических условиях оборудуют специальные изолированные помещения - боксы (англ. box - ко­робка), состоящие из собственно бокса и предбоксника. Исполь­зуют также настольные боксы, предметы и воздух в которых обез­зараживают лампами УФИ, и ламинарные шкафы, где кроме это­го применяют активное удаление воздуха.

Лабораторных животных (белых мышей, морских свинок, бе­лых крыс, кроликов и др.) размещают в виварии. Как правило, в виварии содержат также здоровых баранов-доноров, кровь кото­рых используют для реакции связывания комплемента (РСК) и приготовления питательных сред. Зараженных лабораторных жи­вотных содержат в изолированном помещении.

Кроме того, в здании есть комнаты для специалистов, обслужи­вающего персонала, кабинет заведующего, библиотека, весовая, раздевалка, склад и др.

Чтобы поддерживать надлежащую чистоту, пол в комнатах по­крывают линолеумом или кафельной плиткой. Стены и потолки, как правило, гладкие (без карнизов и лепных украшений), с зак­ругленными углами, окрашенные в светлые тона масляной крас­кой. Потолки можно белить известью. Желательно стены облице­вать пластиком или плиткой от пола до потолка.

В лаборатории должны быть горячая и холодная вода, канализация, педальные ведра для мусора, которые ежедневно освобождают, моют и дезинфицируют, полотенца, мыло и дезинфицирующий раствор. В комнатах находится только самое необходимое оборудование: столы, шкаф для хранения мелкой аппаратуры, красок, реактивов, посуды, инструментов и т. п. Столы обычно устанавливают перед окнами. Они должны быть устойчивыми, удобными, высотой 80 см, с закраинкой. Поверхность столов покрывают пластиком или линолеумом, стеклом или белой специальной краской. На столе размещают микроскоп, а также необходимые предметы для бактериологической работы.

Бактериологический метод исследования, как правило, вклю­чает микроскопию, выделение и изучение свойств чистой культу­ры возбудителя болезни и заражение лабораторных животных (биологическую пробу). Результаты бактериологического анализа за подписью заведующего отделением или директора лаборатории сообщают только официальным лицам: ветеринарному врачу, зоо-инженеру, руководителю предприятия.

Оборудование микробиологической лаборатории.

получения дистиллированной воды (дистиллятор), центрифуги, технические и аналитические весы, аппаратура для фильтрования (фильтр Зейтца и др.), водяные бани, холодильники, аппарат для изготовления ватно-марлевых пробок, набор инструментов (бак­териологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.), лабора­торная посуда (пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флако­ны, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки) и др.

В лаборатории выделено специальное место для окраски мик­роскопических препаратов, где находятся растворы специальных красителей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой, бан­кой с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препарата­ми и другими лабораторными материалами. В крупных лаборато­риях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки серологических реакций.

Для выращивания, хранения культур, стерилизации лаборатор­ной посуды и других целей предназначена следующая аппаратура:

1. 
   Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов составляет 37 "С. Термостаты бывают воздушшными и водяными.
2. 
   Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.
3. 
   Холодильники. Используют в микробиологических лабора­ториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, сывороток, вакцин и прочих биологических препара­тов при температуре около 4 °С. Для хранения препаратов ниже 0°С предназначены низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура -20 "С и ниже.
4. 
   Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганизмов, эритроцитов и других клеток, разделения неоднородных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях используют центрифуги с различными режимами работы.
5. 
   Сушильно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Пред­назначен для воздушной стерилизации лабораторной посуды и других материалов.
6. 
   Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для стери­лизации паром под давлением. В микробиологических лаборато­риях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, го­ризонтальные, стационарные, переносные).

Правила работы в микробиологической лаборатории.

Для уничтожения микроорганизмов в воздухе и на поверхнос­тях существуют различные способы дезинфекции.

Воздух в лаборатории частично очищают проветриванием. Вентиляция резко снижает численность микроорганизмов в воз­духе, особенно при значительной разнице температур снаружи и внутри помещения. Продолжительность проветривания не менее 30...60 мин.

Более эффективный и наиболее часто применяемый способ обеззараживания воздуха - воздействие ультрафиолетовым излу­чением (УФИ), обладающим высоким антимикробным действием и вызывающим гибель не только вегетативных клеток, но и спор микроорганизмов. Из-за слабой проникающей способности ульт­рафиолетовое излучение не проходит через обычное стекло и лег­ко поглощается частицами пыли. Поэтому для стерилизации вре­мя облучения составляет от 30 мин до нескольких часов в зависи­мости от степени загрязненности воздуха.

В качестве источника УФИ используют бактерицидные лампы (УФЛ). Излучателем в них служит электрическая дуга, возникаю­щая в парах ртути низкого давления и испускающая линейный спектр в ультрафиолетовой области, более 80 % энергии которого приходится на длину волны 2,5 нм.

Бактерицидная лампа представляет собой стеклянную трубку, вмонтированную между двумя электрическими контактами и включаемую в сеть через дроссель. Трубка изготовлена из специ­ального стекла, пропускающего все лучи с длиной волны 2,5 нм и задерживающего излучение с длиной волны короче 2 нм. Следует помнить, что УФИ вызывает острое воспаление роговицы глаз с характерным слезотечением и светобоязнью вскоре после облуче­ния. Поэтому для того чтобы прямые или отраженные ультрафио­летовые лучи не воздействовали на глаза, применяют защитные очки. В небольших помещениях при включенной бактерицидной лампе находиться нельзя.

Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории про­тирают растворами различных дезинфицирующих веществ. Обра­ботка пылесосом удаляет с предметов пыль и значительную часть микрофлоры. В качестве дезинфицирующих растворов чаще всего используют 0,5...3%-й водный раствор хлорамина. Особенно тща­тельно следует дезинфицировать поверхность стола, на котором проводится работа с микроорганизмами. Ее необходимо проти­рать дезинфицирующим раствором как перед началом работы, так и после окончания. На рабочем столе недопустимы лишние предметы. Все реактивы и растворы должны быть снабжены этикетка­ми и стоять на строго определенных местах. В лаборатории нельзя есть, пить, курить. Работать следует в халатах.

В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на плотных и в жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы или чашки Петри. Посуду и питательные среды предварительно стерилизуют. Внесение клеток микроорганизмов в стерильную среду называют посевом, или инокуляцией. Посев (или пересев) микроорганизмов требует четкого соблюдения оп­ределенных правил, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами.

Посевы микроорганизмов в стерильные среды лучше всего осу­ществлять в особых помещениях - боксах. Бокс представляет со­бой небольшую изолированную комнату, разделенную перегород­кой на две части. В основное рабочее помещение бокса входят че­рез тамбур, имеющий раздвижную дверь, что исключает резкое перемещение воздуха и, следовательно, занесение извне посто­ронней микрофлоры. Оборудование бокса включает стол с легко-моющейся поверхностью, стул, газовую или спиртовую горелки, бактерицидную лампу, укрепленную в специальном штативе или смонтированную на потолке бокса. В боксе удобно иметь подсоб­ный стол, на котором размешают необходимые во время работы предметы. Все оборудование бокса, его стены, пол и потолок пе­риодически моют и протирают дезинфицирующими растворами. Перед работой бокс облучают бактерицидной лампой в течение 40...60 мин.

После посева пробирки или другие сосуды, в которых выращи­вают микроорганизмы, помещают в термостаты, где с помощью терморегуляторов поддерживается постоянная температура. Посу­ду с культурами микроорганизмов, подлежащими утилизации, подвергают автоклавированию, чтобы убить клетки, и только пос­ле этого моют. В посуду с плотными средами заливают дезинфи­цирующий раствор, который через сутки удаляют, а посуду моют. Неаккуратное обращение с культурами микроорганизмов приво­дит к возникновению бактериального аэрозоля, представляющего опасность для здоровья сотрудников.

Все сотрудники лабораторий, а также кафедр микробиологии, аспиранты, студенты, приходящие на занятия и работающие в на­учно-студенческих кружках, прежде чем приступить к работе с за­разным материалом (культуры патогенных микробов, трупы экс­периментально зараженных животных, выделения больных жи­вотных, кровь и др.) обязаны ознакомиться и строго соблюдать следующие правила работы и техники безопасности в ветеринар­ных бактериологических лабораториях:

в помещение лаборатории входят только в специальной одеж­де: в халате, белой шапочке или косынке. Халат должен быть на­глухо застегнут, волосы убраны под шапочку;

в лабораторию нельзя проносить посторонние веши, продукты питания. Портфели и сумки складывают в специально выделен­ном месте;

в помещении лаборатории категорически запрещается прини­мать пищу, пить и курить;

каждому работнику (студенту) под определенным номером вы­деляют рабочее место, микроскоп и другие принадлежности;

на рабочем месте должно находиться оборудование только для выполнения конкретного задания. Обычно это набор красок, кол­ба с дистиллированной водой, сливная чашка, банки с чистыми и отработанными стеклами, бактериологическая петля, штатив, банка с дезинфицирующим раствором;

перед началом работы необходимо проверить наличие и ис­правность приборов, посуды, газовых горелок (спиртовок) и пр. О замеченных недостатках и неисправностях следует сообщить от­ветственному, а на учебных занятиях - преподавателю;

во избежание взрыва нельзя зажигать одну спиртовку (или га­зовую горелку) от другой; пользуются только спичками;

нельзя касаться проводов и контактных частей электросети ме­таллическими и другими предметами;

студенты без ведома преподавателя или обслуживающего пер­сонала не должны включать электроприборы и аппаратуру;

студенты приступают к выполнению задания только с разреше­ния преподавателя; ход работы должен строго соответствовать изучаемой методике;

каждый: сотрудник и студент должен соблюдать опрятность в работе, содержать в чистоте рабочее место и оборудование;

материал, используемый на учебных занятиях, принимают за особо опасный;

при распаковке материала, присланного для исследования, необ­ходимо соблюдать осторожность: банки снаружи обтирают дезинфи­цирующим раствором и ставят только на подносы или кюветы;

при исследовании поступившего материала и при работе с бак­териальными культурами соблюдают общепринятые в бактерио­логической практике технические приемы, исключающие воз­можность инфицирования работника;

в процессе изучения возбудителей инфекционных болезней студенты должны усвоить особенности правил техники безопас­ности при работе с конкретными возбудителями;

вскрытие трупов экспериментальных (лабораторных) живот­ных производят в специальной одежде на оборудованном столе с помощью необходимых инструментов, используя для этих целей кювету, залитую воском (или парафином). Инструменты после вскрытия на стол класть запрещается: их помещают в стакан с дез-раствором или обжигают над пламенем горелки;

при работе с жидким инфицированным материалом использу­ют резиновые баллоны, соединенные с пипеткой;

если в процессе работы патологический материал случайно по­пал на стол, его немедленно удаляют тампоном, смоченным де­зинфицирующим раствором. При попадании зараженного мате­риала на кожу, конъюнктиву, в ротовую полость принимают экст­ренные меры к обеззараживанию;

по окончании работы патологический материал, использован­ные культуры микроорганизмов, инструменты и поверхность сто­ла обеззараживают;

в конце занятия бактериальные культуры и другой материал студенты должны сдать преподавателю, а рабочее место привести в порядок. Выносить из лаборатории пробирки с культурами, пре­параты (мазки) и другие предметы категорически запрещается;

патологический материал и бактериальные культуры, необхо­димые для дальнейшей работы, оставляют на хранение в закрытом рефрижераторе или сейфе;

перед уходом из лаборатории необходимо снять халат, руки тщательно вымыть и обработать йодированным спиртом. Выхо­дить за пределы лаборатории в халатах запрещается;

соблюдение правил работы и техники безопасности на учебных занятиях по микробиологии контролируют дежурные. С техникой безопасности при работе на кафедре микробиологии студенты знакомятся на первом занятии, о чем расписываются в журнале.

Соблюдая перечисленные правила, сотрудник в лаборатории обеспечивает стерильность манипуляций и предупреждает воз­никновение внутри- и внелабораторного заражения.

Ведение лабораторных записей. Тетрадь для лабораторных работ служит документом, позволяющим контролиро­вать правильность полученных данных. В нее должны быть занесены сведения, имеющие отношение к выполнению данной работы. За­пись необходимо вести аккуратно, четко и в определенном порядке, например: 1) название опыта, дата его постановки и окончания; 2) объект исследования; 3) условия проведения опыта; 4) основной принцип используемого метода анализа; 5) результаты опыта.

Полученные результаты подробно описывают, цифровой мате­риал сводят в таблицы, если необходимо, в графики, диаграммы, рисунки. Каждая лабораторная работа должна заканчиваться соб­ственными наблюдениями и выводами, занесенными в рабочую тетрадь.

В процессе работы студенты овладевают техникой и методами микроскопирования, знакомятся с морфологией представителей различных групп микроорганизмов, осваивают подход к выделе­нию чистых культур и их идентификации, изучают влияние усло­вий и факторов среды обитания на рост и образование разнообраз­ных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов и знакомятся с некоторыми методами генетических исследований бактерий.

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

ПРЕДИСЛОВИЕ

В настоящем учебном пособии представлены лабораторные работы по микробиологии для студентов педагогических университетов по специальностям 1-02 04 01 Биология с дополнительными специальностями и 1-02 04 05-01 География. Биология.

Цель лабораторного практикума - углубление теоретических положений лекционного курса микробиологии и освоение методики микробиологического эксперимента. Пособие включает лабораторные работы по разделам курса: «Морфология и структурнофункциональная организация прокариот», «Физиология и метаболизм прокариот», «Рост и культивирование прокариот», «Систематика и классификация прокариот», «Экология прокариот». В конце каждой работы приводятся вопросы для закрепления теоретического и экспериментального материала. Приведенные работы рассчитаны на 4 часа.

В каждой из предлагаемых работ приведены список материалов

и оборудования, краткие теоретические объяснения, описание хода работы, рекомендации по оформлению результатов. Лабораторные работы содержат справочный материал, позволяющий студенту лучше уяснить содержание лабораторной работы.

Работы выполняются побригадно (2 человека). Выполнению работы предшествует ознакомление с теоретическими положениями и ходом работы, формулирование цели и задач исследования. Пользуясь пособием, студенты оформляют результаты эксперимента в соответствии с учебной картой занятия. Работы предусматривают самостоятельную формулировку выводов с обоснованием полученных результатов. Анализ записей и усвоение изучаемого материала контролируется преподавателем на каждом занятии.

ТРЕБОВАНИЯ К СОДЕРЖАНИЮ И ОФОРМЛЕНИЮ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ

1. Лабораторные работы оформляются в тетради каждым студентом индивидуально. Лабораторная тетрадь подписывается студентом до начала выполнения первой лабораторной работы.

2. Каждая лабораторная работа должна содержать следующие структурные элементы:

1. Наименование лабораторной работы.

2. Цель занятия.

3. Перечень необходимых материалов и оборудования.

4. Результаты и обсуждение: а) наименование задания.

б) указанный в разделе Учебная карта занятия экспериментальный материал, полученный ЛИЧНО студентом в ходе выполнения лабораторной работы.

5. Выводы.

Лабораторная работа, оформленная в соответствии с данными требованиями, представляется в конце КАЖДОГО ЗАНЯТИЯ на подпись преподавателю.

ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

1. К работе в учебной микробиологической лаборатории допускаются лица после прохождения инструктажа по технике безопасности.

2. Запрещается входить в микробиологическую лабораторию в верхней одежде.

3. К занятию допускаются студенты только при наличии медицинского халата.

4. В микробиологическую лабораторию запрещено вносить пищу, питьевую воду, посторонние вещи. В лаборатории запрещается курить

и принимать пищу.

5. За каждым студентом закрепляется постоянное рабочее место (номер рабочего места записывается студентом на титульном листе лабораторной тетради).

6. На рабочем месте размещаются только необходимые для выполнения конкретной лабораторной работы оборудование и материалы.

7. Приступать к работе и перемещаться по лаборатории во время занятия только с разрешения преподавателя.

8. При работе с микроорганизмами соблюдать осторожность и придерживаться приемов, исключающих возможность инфицирования.

9. Запрещается прикасаться к микробным культурам руками.

10. Если микроорганизмы случайно попали на стол, следует немедленно удалить их тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. При работе с жидкой культурой пользоваться спецсредствами для забора микроорганизмов.

10. Не зажигать одну спиртовку от другой. Закрывать фитиль спиртовки колпачком между использованиями.

11. Соблюдать меры безопасности при обращении с электроприборами. Перед работой проверить исправность электрооборудования. Без разрешения преподавателя не включать электроприборы в сеть.

12. В конце работы привести в порядок рабочее место. Тщательно вымыть руки и обработать ватным тампоном с дезинфицирующим раствором. Халат сложить в полиэтиленовый пакет.

13. Выполнение правил техники безопасности контролируют дежурные студенты, которые также проверяют в конце занятия порядок рабочих мест.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОКАРИОТ. МОРФОЛОГИЯ

ПРОКАРИОТ

Цель занятия. Ознакомиться с оборудованием рабочего места в микробиологической лаборатории, техникой безопасности при работе с микроорганизмами. Овладеть методиками приготовления основных микробиологических препаратов. Изучить морфологические формы бактерий на примере чистых культур микроорганизмов и микрофлоры полости рта.

Материалы и оборудование: инструкция по технике безопасности при работе с культурами микроорганизмов; журнал по технике безопасности; посевы микроорганизмов на чашках Петри, в пробирках со скошенным агаром; спички, карандаш по стеклу; вазелин; иммерсионное масло; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; шпатель Дригальского; пипетка Пастера; пипетка стеклянная градуированная; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги.

1. Ознакомиться с оборудованием рабочего места и техникой безопасности при работе с микроорганизмами.

2. Изучить методы исследования микроорганизмов.

3. Овладеть методами приготовления микробиологических препаратов.

4. Изучить морфологические формы микроорганизмов.

5. Закрепить полученные знания при исследовании микрофлоры полости рта.

Задание 1. Ознакомиться с техникой безопасности при работе с микроорганизмами и оборудованием рабочего места в микробиологической лаборатории.

Работа в микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения техники безопасности.

В Республике Беларусь и России по степени опасности для человека и окружающей среды выделено 4 группы возбудителей инфекционных заболеваний, более низкий номер группы означает возрастающий риск при выполнении лабораторных исследований.

I группа – возбудители особо опасных инфекций: чумы, натуральной оспы, геморрагических лихорадок (Ласса, Эбола и др.).

II группа – возбудители высококонтагиозных бактериальных, грибковых и вирусных инфекций: сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии, холеры, сыпного тифа, бластомикоза, бешенства, СПИДа, гепатитов В и С и др., ботулотоксины и столбнячный токсин.

III группа – возбудители других инфекций: коклюша, столбняка, ботулизма, туберкулёза, трихомониаза, малярии, лейшманиоза, гриппа, полиомиелита, герпесвирусы и др.

IV группа – условно-патогенные (возбудители газовой гангрены, клебсиеллы, стафилококки, стрептококки, синегнойная палочка, некоторые кандиды и аспергиллы, аденовирусы, ротавирусы, энтеровирусы и др.) и непатогенные микроорганизмы.

На лабораторных занятиях студенты работают с непатогенными микроорганизмами. Однако необходимо помнить, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть внесена и патогенная микрофлора.

Подготовка микробиологической лаборатории к работе. Для того чтобы снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях, в лабораторных помещениях применяют различные способы дезинфекции .

Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения через форточку (не менее 30–60 мин) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом помещения. Более эффективный и наиболее часто применяемый способ дезинфекции воздуха – облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 200 до 400 нм.

Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки. Рабочий стол следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания. Для протирания поверхности стола можно использовать растворы лизола и хлорамина, а также 70%-ные (по объему) растворы изопропилового или этилового спиртов.

Для работы в учебной микробиологической лаборатории используется следующие оборудование:

1. Микроскоп. Биологический микроскоп (рис. 1) представляет собой оптический прибор, увеличивающий предметы в 40-1500 раз; состоящий из механической, оптической и осветительной систем. К механической системе микроскопа относятся подковообразная ножка, тубусодержатель, тубус, предметный столик, винты. Оптическая система включает объективы и окуляр. Осветительная система состоит из конденсора с диафрагмой и зеркала.

микроскопа. В верхнюю часть тубуса вставлен окуляр, а в нижнюю – вращающийся вокруг своей оси револьвер, в который ввинчены объективы. Тубус передвигается вверх и вниз при помощи макрометрического и микрометрического винтов. Один оборот микрометрического винта передвигает тубус на 0,1 мм. Поэтому микровинтом пользуются для более точной наводки, а для предварительной - макровинтом. Предметный столик предназначен для размещения исследуемого материала.

Рисунок 1 - Микроскоп

1 - макровинт;2 - тубусодержагель;3 - шарнирное соединение;4

- предметный столик; 5 - тубус;6 - окуляр; 7- револьвер;8 - объективы;9 - конденсор;10 - зеркало;11 - микровинт;12 -

подковообразное основание Конденсор состоит из линз, собирающих отраженные от зеркала

лучи в световой пучок, и направляющих его через отверстие предметного столика на препарат. При определении подвижности неокрашенных препаратов конденсор должен быть несколько опущен.

Диафрагма находится между зеркалом и кондесором и служит для регулирования количества света, поступающего в конденсор.

Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя линза служит для увеличения предмета, остальные - для коррекции изображения. Современные биологические микроскопы имеют не менее трех объективов. Сухие объективы увеличивают в 8 и 40 раз (между объективами и препаратом находится слой воздуха), иммерсионные - в 90 раз. На оправу каждого объектива нанесена цифра, указывающая увеличение.

Окуляр состоит из верхней - глазной и нижней - собирательной линз. На верхней части окуляра имеется цифра, указывающая увеличение (7, 10, 15). Окуляр увеличивает только изображение. Общее увеличение микроскопа складывается из произведения увеличения объектива на увеличение окуляра.

Рабочий стол для микроскопирования препаратов желательно размещать у окна или оснащать источником света. Микроскоп устанавливают на рабочий стол к себе тубусодержателем примерно на 7-10 см от края. Вначале проводят настройку освещения, для чего зеркалом направляют пучок света от источника освещения в объектив с увеличением в 8 раз. При правильной настройке освещения поле зрения микроскопа должно быть в виде равномерно освещенного круга. После этого на предметный столик помещают исследуемый препарат, который закрепляют клеммами и рассматривают под микроскопом, пользуясь объективами с увеличением в 8, 40 или 90 раз.

При работе с объективами 8 и 40 тубус микроскопа осторожно опускают с помощью макрометрического винта, приближают объектив почти вплотную к препарату, но не касаются его. Наблюдают в окуляр, слегка приподнимая тубус тем же винтом до получения изображения. С помощью микрометрического винта проводят точную установку объектива до получения четкого изображения предмета.

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Глава I. Микроскоп и техника микроскопиропания
1. Светооптическая микроскопия
2. Микроскопия в темном поле
3. Фазово-контрастная микроскопия
4. Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия
Глава II. Общие представления о культивировании, технике посева и необходимом оборудовании для работы с микроорганизмами
Глава III. Методы приготовления препаратов микроорганизмов
Глава IV. Исследование микробной клетки
1. Формы клеток микроорганизмов
2. Строение клеток микроорганизмов (цитохимические методы исследования)
3. Окраска клеток микроорганизмов по Граму
4. Окраска спор у бактерий
5. Окраска капсул
6. Окраска жгутиков
7. Окраска ядерного вещества бактерий
8. Окраска включений клеток микроорганизмов
Глава V. Питание микроорганизмов
1. Значение отдельных питательных элементов
2. Приготовление питательных сред
3. Методы стерилизации
Глава VI. Учет численности бактерий и выделение чистой культуры
1. Учет численности бактерий в почве
2. Определение качественного состава бактерий
3. Учет численности микроорганизмов в воде и других жидкостях
4. Учет численности бактерий в воздухе
5. Выделение чистых культур бактерий
Глава VII. Определение вида бактерий
Глава VIII. Превращение микроорганизмами безазотистых органических веществ
Процессы брожения
1. Спиртовое брожение
2. Молочнокислое брожение
3. Маслянокислое брожение
4. Брожение пектиновых веществ
5. Брожение целлюлозы
6. Окисление клетчатки
7. Окисление жира
8. Окисление углеводородов
Глава IX. Превращение микроорганизмами органических и минеральных соединений азота
1. Аммонификация
2. Нитрификация
3. Денитрификация (нитратное дыхание)
4. Биологическая фиксация атмосферного азота
Глава X. Превращение микроорганизмами соединений серы, железа и фосфора
1. Превращение микроорганизмами соединений серы
2. Участие микроорганизмов в превращении железа
3. Превращение микроорганизмами соединений фосфора
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Глава XI. Общий микробиологический анализ почвы
1. Методы исследований
2. Группы микроорганизмов, состав и приготовление питательных сред
3. Взятие средней почвенной пробы и подготовка образца к микробиологическому анализу
4. Приготовление почвенной суспензии
5. Учет различных групп микроорганизмов
6. Определение общего количества микроорганизмов в почве методом прямого счета под микроскопом
Глава XII. Изучение ценозов микроорганизмов
1. Метод обрастания стекол по Н. Г. Холодному
2. Изучение микробных ценозов в почве по методу Перфильева и Габе
3. Метод капилляров Перфильева в модификации Аристовской
4. Выявление микроорганизмов автохтонной группы, участвующей в разложении гумусовых веществ, по методу Виноградского в модификации Теппер
5. Выявление микроорганизмов, участвующих в разложении гумусовых веществ, по методу Теппер
Глава XIII. Определение биологической активности почвы
1. Определение биологической активности почвы по интенсивности разложения полотна (метод Мишустина, Вострова и Петровой)
2. Определение общей микробиологической активности почвы по выделению углекислого газа
3. Определение аммонифицирующей активности почвы
4. Определение аммонифицирующей активности микроорганизмов
5. Определение нитрифицирующей активности почвы
6. Определение денитрифицирующей активности почвы
7. Определение азотфиксирующей активности микроорганизмов
Глава XIV. Изучение бактерий корневой зоны растений и на корнях
1. Учет бактерий в ризосфере методом Красильникова
2. Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней по Е. 3. Теппер
3. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий, количественный учет в почве, определение их активности и вирулентности
Глава XV. Анализ бактериальных препаратов
Глава XVI. Микробиология кормов
1. Эпифитная микрофлора зерна и ее изменение при хранении корма
2. Анализ силоса
3. Дрожжевание корма
Глава XVII. Микрофлора молока и молочных продуктов
1. Бактериологический анализ молока
2. Методы выделения молочнокислых бактерий в чистую культуру
3. Знакомство с микрофлорой сливочного масла
Указатель литературы